上海生物发酵产品与技术装备展
2021年11月20-22日 上海新国际博览中心

两步层析纯化腺病毒载体生产工艺

腺病毒是一种非常有效的转基因载体,可插入至37Kb的外源基因,高效的转导效率,可转导不同类型的人组织细胞,不受靶细胞是否为分裂细胞所限制,容易得到高低度,进入细胞内而不整合到宿主细胞基因组,仅瞬间表达,安全性高。由于以上在临床上得到广泛的应用。

为了提高腺病毒载体的基因容量,安全性,科学家利用基因工程技术,不断地对腺病毒载体急性改造。第一代腺病毒载体是将E1和E3基因剔除,提高了其免疫原性,可以插入4.5Kb的外源基因。第二代腺病毒载体,剔除了E2/E4基因,载体容量得到了提高,但是与第一代比较,免疫反应比较弱,产量比较低,滴度降低。第三代腺病毒载体也称为辅助病毒载体(helper-dependent vector)或无病毒载体(gutless vector),指全部或大部分腺病毒基因组缺失,仅保留了ITR和包装信号序列。外源基因容量大幅度提高,可达37Kb,由于无病毒蛋白表达,降低了免疫反应,安全性得到了大幅提高。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。

大规模腺病毒下游纯化面临着巨大的挑战:一个完整的腺病毒颗粒,包含2700多种蛋白亚基,分子量达165MDa,分子大小约为0.1um。这些复杂的颗粒很容易产生成千上万钟的电荷异构体,给下游纯化带来巨大的压力,增加了纯化的复杂性。

Bio-Rad经过多种填料的筛选,优化工艺,最后采用两步层析,可以有效去除宿主蛋白,核酸等杂质,获得高活性的,高纯度,浓缩腺病毒,质量达到了临床应用的级别。该工艺简单,步骤之间易于衔接,非常适合产业化放大。

工艺总结:

1、利用Nuiva cPrime混合机制填料高分辨率,洗脱温和的特点,快速捕获和浓缩腺病毒载体;

2、利用Nuvia Q可以耐受一定高盐,而且高盐浓度下可以增加腺病毒载量,减少填料用量;

3、该工艺各步骤之间衔接良好,无需更换缓冲液,仅需要稀释和微调pH即可上样,工艺放大简单;

4、工艺回收率达到54%,DNA低于检测限,HCP低于2ng/1010 particles, 满足临床需要。

2021第九届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会暨上海国际生物工程装备技术展

地点:上海新国际博览中心龙阳路2345号)W3、W4、W5馆

时间:2021年11月20-22日

BIO CHINA 2021上海生物发酵展,目前已成为生物发酵产业一年一度行业盛会,展会将围绕,生物工程、发酵工程、细胞工程、蛋白工程、生物医药(抗生素、疫苗等)、生物饲料、生物农药、生物肥料、生物化工、食品发酵、发酵产品(氨基酸及有机酸、淀粉及淀粉糖、酵母及衍生物、酶制剂、发酵功能制品)等产业化中的新产品、新技术、新装备、新工艺为主要展示内容,打造集“展示、商贸、学习、交流”为一体的全产业链覆盖,引领行业专业综合服务平台!打造高标准国际化的生物发酵生态圈。

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2021第九届上海国际生物发酵产品与技术装备展览会

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