2022第九届济南国际生物发酵产品与技术装备展览会
2022年3月30-4月1日 山东国际会展中心

【生物发酵展资讯】发酵调控基础篇:最详尽的IPTG诱导原理

本文摘要

        基因工程菌是通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。不熟悉诱导原理就无法真正的理解现在发酵技术,更无法理解合成生物学的发展和未来。

本文希望通过介绍乳糖操纵子的结构、相应的概念,以及IPTG的作用原理,能够让大家更加深入的理解基因工程菌的调控原理和方法,如果您觉得本文有价值,请分享到朋友圈,您的分享就是对本公号最大的支持。

 乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群,由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成,使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。1961年雅各布(F.Jacob)和莫诺德(J.Monod)根据对该系统的研究而提出了著名的操纵子学说,影响非常深远。

01、操纵子

        细菌相关功能的结构基因常连在一起,形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控,一开俱开,一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位,其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中。

// 操纵子

        操纵子(operon)是原核生物基因组特有的组织结构,它由多个毗邻的结构基因加上相关的调控序列构成,调控序列包括启动子和操作基因。本文以最具代表性的乳糖操作子进行详细介绍,希望起到一通百通的效果。

// 启动子

        启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列,它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列,多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。

// 操纵基因

        操纵基因是操纵子中的控制基因,在操纵子上一般与启动子相邻,通常处于开放状态,使RNA 聚合酶通过并作用于启动子启动转录。但当它与调节基因所编码阻遏蛋白结合时,就从开放状态逐渐转变为关闭状态,使转录过程不能发生。

// 结构基因

结构基因是指编码任何蛋白质或非调控因子的RNA的基因,是操纵子的一部分。它编码的内容呈现广泛的功能和结构,包括结构蛋白、酶类(如催化酶)或不执行调控功能的RNA分子

        乳糖分解代谢相关的三个基因,lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇。它们的产物可催化乳糖的分解,产生葡萄糖和半乳糖。其中:

lacZ编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),此酶由500kd的四聚体构成,它可以切断乳糖的半乳糖苷键,而产生半乳糖和葡萄糖。

lacY编码β一乳糖转移酶(lactose permease),这种酶是一种分子量为30kDd膜结合蛋白,它构成转运系统,将半乳糖苷运入到细胞中。

lacA编码β-硫代半乳糖苷转乙酰基酶(thiogalactoside transacetylase),其功能只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上。

// 阻遏蛋白

        阻遏蛋白(repressor protein)是基于某种调节基因所制成的一种控制蛋白质,在原核生物中具有抑制特定基因(群)产生特征蛋白质的作用。由于它能识别特定的操纵基因(即操纵子是阻遏蛋白的结合位点),当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合,或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动,阻遏转录,介导负性调节,因而可抑制与这个操纵基因相联系的基因群,也就是操纵子的mRNA合成。

// 操纵子工作原理

        在没有诱导物(乳糖或IPTG)存在时,Lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录启动。

        诱导物(乳糖或IPTG)存在时,它们与阻遏物结合,导致阻遏物从操纵基因上下来,RNA聚合酶可通过启动子和操作基因正常转录出mRNA,从而进一步的合成出三种酶。

02、安慰诱导物

// 为什么使用IPTG作为诱导剂

        由于乳糖虽可诱导酶的合成,但又随之分解,产生很多复杂的动力学问题,因此常用安慰诱导物来进行各种实验。IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)是最典型的安慰诱导物。

        IPTG中,半乳糖苷键中用硫代替了氧,虽然失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同。

//IPTG的优点

        IPTG不被菌体代谢,为乳糖类似物,一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果,所以IPTG的诱导效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢,在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响,诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用,既能做为诱导剂异乳糖的前体物质,又可以做碳源,在诱导过程中,很不稳定,IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。

//IPTG的处理

        IPTG在使用之前需要溶解和除菌,溶解直接使用无菌水进行溶解,溶解后在超净工作台内使用无菌过滤器抽滤,如果不能现配现用,则可以根据每次使用量,在除菌后,将其分装到无菌瓶中,计算一周内使用完的,建议放置到2-8度冷藏,如果长期保存,建议放置到-20度进行冷冻保存,冷冻保存时不可使用玻璃瓶分装。

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文章来源:发酵人社区微信公众号,发酵展周彬整理发布

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