2022第九届济南国际生物发酵产品与技术装备展览会
2022年3月30-4月1日 山东国际会展中心

培养基优化新思路–代谢组学优化培养基

我们通常用的优化微生物培养基的方法是采取单因素,多因素等手段选择合适的碳源,氮源,碳氮比等参数。属于暗箱操作,我们直接跨过了去了解微生物对营养物质的需求,而直接通过营养物质和表型的关系,来获得较优的培养基组成,当然这是非常有效的一种手段。但是我们需要对微生物生产对营养物质的需求有更多的了解,接下来给大家介绍一篇通过代谢组学的方法来优化培养基的思路,供大家参考。

一、文章目的

以毕赤酵母生物量为考核指标,以期通过培养基优化,寻找无机盐培养基(BSM,D’Anjou,,Stratton共三种文献报道的用于毕赤酵母工业化生产的无机盐培养基,其特征是培养基由无机盐和微量元素组成,碳源为甘油,碳源为氨水和硫酸铵,因此在摇瓶中,菌体培养效果远远低于BMGY))和复合培养基(BMGY)之间的营养差异,通过代谢组学的方法,弥补该差异,从而获得改良的无机盐培养基。

二、文章主要实验内容

1. 无机盐培养基和复合培养基对菌体生长的影响

野生菌株在BSM中的生长速度低于在BMGY中的生长速度,比生长速率分别为0.187h-1和0.247h-1。并且这种差异并不是由于pH值的差异导致的。在BSM培养基中加入蛋白胨,酵母粉和YNB,也仅仅能将比生长速率提高到0.203h-1。这就表明在BSM培养基中有某种营养成分是过量的,从而不利于菌体的生长。BSM培养基是为了在发酵罐中获得毕赤酵母高密度发酵而设计的,并不适应小规模的应用。

 

在BSM中甘油提供碳源,已经有实验证明4%以下的甘油浓度不会对毕赤酵母的生长产生影响。氮源由氨水提供,磷和硫由硫酸盐和磷酸盐提供。为了验证上述论证,设置了三组实验,分别将氨水,硫酸盐和磷酸盐减少50%,为了维持pH值的稳定性,分别用氢氧化钾(减少氮源)和氢氧化铵调节PH(减少磷)。由下图可看出,减少硫元素,生物量大大降低,减少氮源氨水的含量,则可以使得生物量有些许提高。

进一步研究表明当氨水浓度大于50mM时氨水浓度和菌体生长成速率成负相关,因此有必要控制氨水浓度,见下图。但是即便我们将氨水浓度降低到25mM,菌体生长速率和BMGY也存在较大的差异。

 

进一步我们将FM22培养基和Anjou 培养基也作为我们的考察范围之内,两者的无机盐含量整体上比BSM培养基低很多。有研究表面,酿酒酵母在无机盐培养基上生长需要更多的能量。分别设置BSM、FM22和Anjou和培养基的氨水浓度为25mM,用氢氧化钾调节pH到6.5。结果显示具有更低无机盐浓度的Anjou的培养基获得了更高的比生长速率,这说明整体无机盐浓度(渗透压)对毕赤酵母的生长也是不利的。因此选择d’Anjou无机盐培养基开展进一步优化。

 

在Anjou的基础上,增加酵母粉,蛋白胨和YNB,可以使得比生长速率提高到0.251h-1接近于BMGY中的比生长速率。表明,Anjou培养基和BMGY培养基之间的差异主要在于缺少某些中间代谢产物。

因此,进一步我们优化营养补充剂,以弥补基础盐培养基和BMGY之间的差异。

2.酵母粉和蛋白胨中的关键营养因子

(1)氨基酸的优化

已经有研究表明氨基酸可以提高外源蛋白的表达水平,而氨基酸也可以替代氨水作为氮源。我们首先分析蛋白胨中的氨基酸组成,以减少筛查范围。

 

根据蛋白胨氨基酸的组成,选择精氨酸,丙氨酸、赖氨酸以及谷氨酰胺进行下一步的研究。其中谷氨酰胺经常用于细胞培养中,所以也在考虑范围之内。数据表明,谷氨酰胺可以显著提高比生长速率,谷氨酰胺是众多氨基酸的前提物质。精氨酸也能显著提高比生长速率。

 

(2)酵母提取物中的有效物质

酵母提取物中的碳源之前已经被表征过,分别为乳糖和海藻糖,在复合培养基中最终的浓度分别为10mM和5mM。此外酵母提取物中还含有维生素和核苷酸。实验表明,维生素可以显著提高菌体的生长速率,核苷对生长没有什么影响,海藻糖对生长没有明显影响,乳糖明显抑制生长。

(3)优化获得第一代培养基并评估

经过筛选,我们最终确定了50mM的铵离子,5mM谷氨酰胺、5mM精氨酸和维生素溶液组成的第1代培养基。进一步我们对该培养基进行了评估(下图中黄色曲线)。

由结果可以看出,第一代培养基的比生长速率接近BMGY的,高于BSM和Anjou培养基,但是总生物量还是有差异。由结果可以看出,在发酵培养24h后,甘油消耗完全,限制了第一代培养基的生长,但是BMGY由于有其他替代碳源可以继续维持生长,因此可以获得较高的生物量。另外pH值的变化可能也对生物量较低低,产生了影响(这种影响可以在发酵罐中弥补)。另外我们监测了发酵过程中氮源的变化,其中铵的含量在24h时消耗了大部分,但是并未降低到0,说明氮源供给是充足的。而氨基酸含量在8h时就消耗完全,不能满足需要,因此有必要提高起始浓度。

 

(4)在第一代培养基中的转录组学研究

我们分别对酵母菌体在BMGY,Anjou培养基和新一代培养基中的代谢组进行了表征,以研究由于培养基的影响带来的代谢变化。总体基因水平在三种培养基中相似度很高,但是个别基因有明显的差异。

Anjou培养基和BMGY之间有112个基因表达差异较大,而新一代培养基和BMGY之间的这种差异仅有67个。结果表明新一代培养基和BMGY之间的差异仍然并未完全弥补。

Anjou培养基和BMGY之间,差异较大的基因为INO1, THI13, THI20, THI4, SNZ2, and THI6,这些基因都和维生素的合成相关,并且在Anjou培养基中上调,这说明其维生素的缺乏。这和我们之前的实验结果相吻合(添加维生素对生长有利)

 

新一代培养基和BMGY相比,ARO10是BMGY培养基中主要的上调基因,POX1, CAR1, POT1, and GDH3是新一代培养基中主要的上调基因。除CAR1基因外,在Anjou培养基中,这些基因也上调。ARO10和氨基酸的分解代谢相关,BMGY培养基中的上调可能意味着BMGY中存在着可以被利用的肽。POX1 和 POT1和脂肪酸代谢有关,CAR1和精氨酸代谢有关。GDH3和谷氨酸合成和代谢有关,该基因的上调可能是由于培养基中缺少相应氨基酸导致的。因而增加相应的氨基酸和脂肪酸可能提高菌体生长。这些差异基因的差异表达绝对值小于Anjou培养基和BMGY培养基基因的绝对值,这表明他们并不是很重要。实验表明,在培养基中加入脂肪酸和提高氨基酸有利于细胞增殖。

进一步作者通过将转录组数据映射到基因组规模的代谢网络中,并使用报告代谢物算法来识别表达变化集中的代谢物,从而来确定备选培养基成分。首先作者通过已知的维生素因素验证了该模型的准确性(已经实验证明生物素的有效性)。通过该模型分析,确定了脂肪酸的重要性,另外肌醇和烟酸也很重要。

(5)最终培养基

因此在代谢组学分析的基础上,通过加入 7种脂肪酸,胆固醇和一些表面活性剂,并将谷氨酰胺和精氨酸加倍,形成新的培养基,将该培养基命名为RDM,RDM的比生长速率略有增加,当我们对RDM中生长的细胞进行测序时,我们发现与辅酶A相连的脂肪酸酰基不再是显著的报告代谢物,证实了脂肪酸被代谢。RDM和BMGY之间其余的差异表达基因主要反映了氨基酸组成的差异,如上述ARO10和GDH3。通过对RDM培养基中外源表达基因的评估,表明该培养基对外源基因的表达也是有利的。

 


参考文献:

Catherine B. Matthews,Angel Kuo,Development of a general defined medium for Pichia pastoris

文章来源:微生物发酵公众号 作者芦山雪 生物发酵展周彬整理发布

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